title: Construction of biologically active recombinant proteins: Interleukin-36 gamma (IL-36g) and Interleukin-36 receptor antagonist (IL-36RA)
metadata.name: dc.contributor.advisor
metadata.value: Макашов Андрей Андреевич
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.contributor.author
metadata.value: Хижина Айгуль Альфретовна
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.contributor.author
metadata.value: Aigul Khizhina
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.contributor.editor
metadata.value: Леонова Лариса Евгеньевна
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.contributor.editor
metadata.value: Leonova Larisa Evgenevnа
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.date.accessioned
metadata.value: 2018-07-26T15:17:39Z
metadata.lang: -
metadata.name: dc.date.available
metadata.value: 2018-07-26T15:17:39Z
metadata.lang: -
metadata.name: dc.date.issued
metadata.value: 2018
metadata.name: dc.identifier.other
metadata.value: 014265
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.identifier.uri
metadata.value: http://hdl.handle.net/11701/12327
metadata.lang: -
metadata.name: dc.description.abstract
metadata.value: Семейство интерелейкина-36 (ИЛ-36) включает в себя: 3 агониста ИЛ-36α, β, γ и один антагонист ИЛ-36РА. Агонисты, связываясь с их общим рецептором – ИЛ-36Р, активируют сигнальные пути NF-kВ и/или МАРК. Антагонист же, связываясь с ИЛ-36Р, препятствует передаче сигнала. Цитокины ИЛ-36 вовлечены в воспалительные процессы в коже, в том числе в патогенез псориаза.   Псориаз - это аутоиммунное заболевание кожи, которое встречается примерно у 2% населения в развитых странах. При псориатическом воспалении резко повышается продукция провоспалительных цитокинов кожи - ИЛ-36α, ИЛ-36β, ИЛ-36γ -, в отдельных случаях в 100 раз. Среди них наиболее сильным маркером является ИЛ-36γ. Это позволяет использовать его в диагностических целях, как мишень антицитокиновой терапии, направленной на лечение псориаза, или для моделирования псориаза. Мутации в гене IL36RN, кодирующем ИЛ-36РА, ассоциированы с развитием тяжелейшей формы псориаза – генерализованного пустулезного псориаза. Следовательно, ИЛ-36РА может служить потенциальным средством для лечения псориаза.   В настоящей работе описано получение биологически активных рекомбинантных белков ИЛ-36РА и ИЛ-36γ человека. Для максимальной биологической активности молекулам ИЛ-36РА и ИЛ-36γ необходим протеолиз. Для получения биологически активной формы ИЛ-36РА важно отщепление N-концевого остатка метионина. Для получения биологически активной формы ИЛ-36γ важно отщепление N-концевого сигнального пептида, поэтому для получения рекомбинантного ИЛ-36γ мы использовали модифицированный ген IL36G, кодирующий уже процессированную форму ИЛ-36γ, которая начинается с 18-го а.к.о. серина. Однако биологическая активность такого рекомбинантного ИЛ-36γ недостаточно высокая по сравнению с препаратами описанными в литературе. Мы предположили, что причиной понижения биологической активности ИЛ-36γ также является недостаточно эффективное отщепление N-концевого остатка метионина.   Для отщепления N-концевого остатка метионина ИЛ-36РА и ИЛ-36γ использовали метод коэкспрессии гена интереса с геном метионинаминопептидазы E. coli (map) под контролем различных промоторов, а также метод экзогенной обработки рекомбинантного белка ИЛ-36РА и ИЛ-36γ рекомбинантной МАП. В случае с рекомбинантным ИЛ-36РА оба метода позволили получить безметиониновые формы ИЛ-36РА с биологической активностью равной активности стандартного образца. Был получен оптимальный штамм- штамм-продуцент ИЛ-36РА – ИЛ-36РА-МАП-BAD. Анализ полученных препаратов проводили при помощи ИФА, ОФ-ВЭЖХ и биологического теста. К настоящему времени эксперимент с ИЛ-36γ не окончен, требуется дополнительный анализ с помощью масс-спектрометрии.
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.description.abstract
metadata.value: The interleukin-36 family (IL-36) includes three receptor agonists namely IL-36α, β, γ and one IL-36 receptor antagonist (IL-36Ra). The agonists activate NF-kB and/or MAPK signal pathways by binding to their receptor (IL-36R). While IL-36Ra interferes with signal transmission by binding to IL-36R without its activation.   IL-36 cytokines are involved in the skin inflammatory processes including the psoriasis pathogenesis. Psoriasis is an immune-mediated inflammatory skin condition affecting approximately 2% of population in developed countries. The proinflammatory skin cytokines IL-36α, IL-36β, IL-36γ are overexpressed in psoriatic skin, sometimes up to 100-fold. IL-36γ is the most strong inflammation marker among them. This fact allows using IL-36γ for diagnostic purposes, as a target of anti-cytokine therapy for psoriasis treatment and for the psoriasis modeling. Mutations in gene encoding IL-36Ra (IL36RN) are associated with the development of generalized pustular psoriasis – the most severe form of psoriasis. Hence, recombinant IL-36Ra potentially can be used for psoriasis treatment.  This work describes the production of biologically active recombinant human IL-36Ra and IL-36γ. Both IL-36Ra and IL-36γ require proteolysis to obtain maximum biological activity. To obtain the biologically active form of IL-36Ra the cleavage of its N-terminal methionine residue is crucial. The N-terminal signal peptide cleavage is necessary to obtain the biologically active form of IL-36γ. Therefore, to produce the recombinant IL-36γ we used a modified IL36G gene encoding the processed IL-36γ form starting from Ser-18. However, the biological activity of such recombinant IL-36γ did not correspond to data presented in literature. We hypothesized that the IL-36γ biological activity is also lowered due to insufficient N-terminal methionine residue cleavage.  For N-terminal methionine residue cleavage from both IL-36RA and IL-36γ we used 2 different strategies. First, the exogenous processing of proteins by recombinant methionine aminopeptidase (MAP). Second, the coexpression of the gene of the interest with the E. coli methionine aminopeptidase (map) gene under control of various promoters. In case of IL-36Ra the fully biologically active protein with cleaved methionine was obtained using both strategies. The optimal methionine-free IL-36Ra producer strain IL-36RA-MAP-BAD was created. The obtained preparations analysis by the methods of ELISA, RP-HPLC and biological test. The experiment with IL-36γ is not yet completed. It requires an additional analysis by mass spectrometry.
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.language.iso
metadata.value: ru
metadata.name: dc.subject
metadata.value: интерлейкин-36РА
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.subject
metadata.value: интерлейкин-36 гамма
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.subject
metadata.value: рекомбинантные белки
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.subject
metadata.value: псориаз
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.subject
metadata.value: метионинаминопептидаза
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.subject
metadata.value: N-концевой остаток метионина
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.subject
metadata.value: interleukin-36Ra
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.subject
metadata.value: interleukin-36g
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.subject
metadata.value: psoriasis
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.subject
metadata.value: methionine aminopeptidase
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.subject
metadata.value: recombinant
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.subject
metadata.value: N-terminal methionine residue
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.title
metadata.value: Construction of biologically active recombinant proteins: Interleukin-36 gamma (IL-36g) and Interleukin-36 receptor antagonist (IL-36RA)
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.title.alternative
metadata.value: Получение биологически активных рекомбинантных белков: интерлейкина-36 гамма (ИЛ-36г) и рецепторного антогониста интерлейкина-36 (ИЛ-36РА)
metadata.lang: ru_RU
resources.filename: Xizhina_A_A__VKRM_finalnaya.docx
resources.url: https://dspace.spbu.ru/bitstream/11701/12327/1/Xizhina_A_A__VKRM_finalnaya.docx
resources.format: Microsoft Word XML
resources.description: Article
resources.size: 2,01 MB
resources.filename: reviewSV_Xizhina_recenziya.pdf
resources.url: https://dspace.spbu.ru/bitstream/11701/12327/2/reviewSV_Xizhina_recenziya.pdf
resources.format: Adobe PDF
resources.description: ReviewRev
resources.size: 2,12 MB
resources.filename: reviewSV_st004931_Leonova_Larisa_Evgenevna_(supervisor)(Ru).txt
resources.url: https://dspace.spbu.ru/bitstream/11701/12327/3/reviewSV_st004931_Leonova_Larisa_Evgenevna_%28supervisor%29%28Ru%29.txt
resources.format: Text
resources.description: ReviewSV
resources.size: 3,91 kB