title: Muscle transfection with DNA-cationic peptides complex coated with anionic peptides
metadata.name: dc.contributor.advisor
metadata.value: Слита Александр Валентинович
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.contributor.advisor
metadata.value: Slita Aleksandr Valentinovic
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.contributor.author
metadata.value: Девяткин Дмитрий Михайлович
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.contributor.author
metadata.value: Devatkin Dmitrij Mihajlovic
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.contributor.editor
metadata.value: Барабанова Лариса Владимировна
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.contributor.editor
metadata.value: Barabanova Larisa Vladimirovna
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.date.accessioned
metadata.value: 2023-07-26T12:03:08Z
metadata.lang: -
metadata.name: dc.date.available
metadata.value: 2023-07-26T12:03:08Z
metadata.lang: -
metadata.name: dc.date.issued
metadata.value: 2023
metadata.name: dc.identifier.other
metadata.value: 077064
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.identifier.uri
metadata.value: http://hdl.handle.net/11701/42178
metadata.lang: -
metadata.name: dc.description.abstract
metadata.value: Доставка нуклеиновых кислот в мышечную ткань является актуальной проблемой развития генной терапии нервно-мышечных заболеваний, а также необходима при использовании мышечной ткани для наработки фермента в случае терапии некоторых метаболических болезней и мРНК- и ДНК-вакцинации. Трансфекция мышечной ткани считается одной из наиболее трудноосуществимых по нескольким причинам, в том числе из-за малого количества рецепторов на поверхности клеток, необходимых для направленной доставки, и отсутствия митотических делений в миофибриллах, что усложняет попадание плазмидной ДНК в ядро.
  Ранее нами были разработаны невирусные носители на основе аргинин-гистидин-богатых пептидов, была показана их способность доставлять ДНК в клетки. Для повышения устойчивости комплексов в биологической среде организма было разработано анионное пептидное покрытие. Актуальной задачей является уменьшение объема упаковки ДНК, что позволит доставлять большее количество терапевтических конструкций в мышцы в меньшем объеме.
  Целью работы является изучение катионных и анионных пептидных носителей в качестве транфекционного агента мышечной ткани животных. 
  Были синтезированы аргинин-гистидин-богатые пептидные носители, а также анионные пептиды, содержащие глутаминовую кислоту, и сформированы комплексы с плазмидами, несущими ген 𝛽-галактозидазы или зеленого флуоресцентного белка. Изучена эффективность связывания носителей с ДНК, а также физико-химические свойства формируемых комплексов. Была проведена трансфекция клеток линии C2C12 с последующей оценкой токсических свойств комплексов и анализом трансфекционной активности. Были выполнены внутримышечные инъекции мышей растворами комплексов с последующим анализом экспрессии гена GFP в мышечных волокнах на флуоресцентном микроскопе.
  С помощью теста на вытеснение бромистого этидия было показано, что снижение объема упаковки не оказывает негативного влияния на связывание носителей с ДНК. Дзета-потенциал и размер большинства формируемых комплексов являются оптимальными для трансфекции. Токсичность, оцениваемая с помощью красителя Alamar Blue, не превышала порог в 20% для всех типов комплексов. Эффективность трансфекции комплексами, приготовленными в малом объеме, оцененная с помощью MUG-теста на активность 𝛽-галактозидазы и с помощью анализа GFP+ клеток на цитофлуориметре, была сопоставима с таковой комплексами, приготовленными в большом объеме. Увеличение дозы вводимой ДНК в 5 раз при внутримышечном введении за счет уменьшения объема упаковки увеличило эффективность трансфекции in vivo.
  Таким образом, уменьшение объема упаковки комплексов не снижает их трансфекционную активность и эффективность связывания ДНК пептидными носителями, а также не приводит к увеличению токсических эффектов, связанных с введением исследуемых комплексов, для клеток C2C12. Уменьшение объема упаковки увеличивает эффективность трансфекции in vivo за счет увеличения дозы ДНК.
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.description.abstract
metadata.value: Delivery of nucleic acids into muscle tissue is an urgent problem in the development of gene therapy for neuromuscular diseases, and is also necessary when using muscle tissue for enzyme production in the treatment of certain metabolic diseases and mRNA and DNA vaccination. Transfection of muscle tissue is considered one of the most difficult to implement for several reasons, including the small number of receptors on the cell surface required for targeted delivery and the lack of mitotic divisions in myofibrils, which complicates the entry of plasmid DNA into the nucleus.
  Previously, we have developed non-viral carriers based on arginine-histidine-rich peptides, and have shown their ability to deliver DNA to cells. An anionic peptide coating was developed to increase the stability of the complexes in the biological environment of the body. An urgent task is to reduce the volume of DNA packaging, which will allow delivering a larger number of therapeutic constructs to muscles in a smaller volume.
  The aim of this work is to study cationic and anionic peptide carriers as a transfection agent in animal muscle tissue.
  Arginine-histidine-rich peptide carriers were synthesized, as well as anionic peptides containing glutamic acid, and complexes were formed with plasmids carrying the 𝛽-galactosidase or green fluorescent protein gene. The efficiency of binding of carriers to DNA, as well as the physicochemical properties of the formed complexes, have been studied. The cells of the C2C12 line were transfected, followed by an assessment of the toxic properties of the complexes and an analysis of the transfection activity. Intramuscular injections of mice with solutions of the complexes were performed, followed by analysis of the GFP gene expression in muscle fibers using a fluorescent microscope.
  Using the ethidium bromide displacement test, it was shown that the reduction in package volume does not adversely affect the binding of carriers to DNA. The zeta potential and the size of most of the formed complexes are optimal for transfection. Toxicity, assessed using the Alamar Blue dye, did not exceed the threshold of 20% for all types of complexes. The transfection efficiency of complexes prepared in a small volume, assessed using the MUG test for 𝛽-galactosidase activity and by analysis of GFP+ cells on a flow cytometer, was comparable to that of complexes prepared in a large volume. A 5-fold increase in the dose of injected DNA with intramuscular injection due to a decrease in the package volume increased the efficiency of transfection in vivo.
  Thus, a decrease in the packing volume of the complexes does not reduce their transfection activity and the efficiency of DNA binding by peptide carriers, and also does not lead to an increase in the toxic effects associated with the introduction of the studied complexes for C2C12 cells. Reducing the packaging volume increases the efficiency of in vivo transfection by increasing the dose of DNA.
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.language.iso
metadata.value: ru
metadata.name: dc.subject
metadata.value: трансфекция
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.subject
metadata.value: пептидные носители
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.subject
metadata.value: невирусные носители
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.subject
metadata.value: генная терапия
metadata.lang: ru_RU
metadata.name: dc.subject
metadata.value: transfection
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.subject
metadata.value: peptide carriers
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.subject
metadata.value: non-viral carriers
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.subject
metadata.value: gene therapy
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.title
metadata.value: Muscle transfection with DNA-cationic peptides complex coated with anionic peptides
metadata.lang: en_GB
metadata.name: dc.title.alternative
metadata.value: Трансфекция мышц комплексами ДНК с катионными пептидами и анионным пептидным покрытием
metadata.lang: ru_RU
resources.filename: VKR.pdf
resources.url: https://dspace.spbu.ru/bitstream/11701/42178/2/VKR.pdf
resources.format: Adobe PDF
resources.description: Article
resources.size: 1,87 MB
resources.filename: VKR.docx
resources.url: https://dspace.spbu.ru/bitstream/11701/42178/3/VKR.docx
resources.format: Microsoft Word XML
resources.description: Article
resources.size: 2,08 MB
resources.filename: reviewSV_Otzyv_naucnogo_rukovoditela_Devatkin.docx
resources.url: https://dspace.spbu.ru/bitstream/11701/42178/4/reviewSV_Otzyv_naucnogo_rukovoditela_Devatkin.docx
resources.format: Microsoft Word XML
resources.description: ReviewSV
resources.size: 15,91 kB