Старая версия сайта | Письмо N 2510/872-04-32 от 02.02.04

Внимание!!! Вы находитесь на старой версии сайта. Новая версия доступна по адресу www.rospotrebnadzor.ru

| О порядке лабораторного исследования тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) |

В настоящее время лабораторная диагностика тяжелого острого респираторного заболевания (ТОРС), вызываемого коронавирусом SARS CoV , осуществляется с помощью выделения вируса в культуре клеток, выявления РНК вируса и антител к антигенам вируса. В Российской Федерации разрешена к применению тест-система для выявления РНК вируса SARS CoV (РУ № 002947/01 от 21.10.2003) производства Центрального НИИ эпидемиологии Минздрав России (приложение № 1). Разработана и проходит регистрацию тест-система для выявления антител к вирусу методом ИФА производства НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород). Для грамотной интерпретации и верификации результатов исследования методом ПЦР и ИФА необходимо соблюдать следующие условия.

Все работы по забору, транспортировке и пробоподготовке клинического материала должны осуществляться с соблюдением санитарных правил по безопасности работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности СП 1.3.1285-03, санитарных правил о порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1-4 групп патогенности СП 1.2.036-95 и методических указаний по организации работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-2 групп патогенности МУ 4.2.-0.3.

Лабораторную диагностику на ТОРС следует проводить у пациентов, с тяжелыми респираторными заболеваниями неясной этиологии (письмо Минздрава России № 2510/10137-03-32 от 10.09.2003 «Клиника и дифференциальная диагностика тяжелого острого респираторного синдрома» Первоочередному обследованию при наличии клинической симптоматики должны подвергаться лица недавно посещавшие регионы, в которых регистрировались случаи ТОРС.

Лабораторную диагностику на ТОРС также следует проводить у лиц без клинических проявлений заболевания

при наличии тесного контакта с подозреваемым на ТОРС больным.

Наиболее эффективно обследование методом ПЦР пациентов в первые 2 недели от начала болезни. Лабораторное обследование контактных лиц должно проводится также на всем протяжении инкубационного периода предполагаемого заболевания.

Антитела к вирусу ТОРС методом ИФА могут быть выявлены у единичных пациентов после 10-14 дня, у 60% пациентов - после 20 дня и практически у 100 % пациентов после 30 дня от момента появления первых симптомов болезни.

Для повышения результативности анализа методом ПЦР целесообразно исследование как минимум трех видов клинического материала: аспират из носоглотки (или мазок из носоглотки), мокрота и фекалии. При невозможности получения от пациента всех перечисленных видов клинического материала, необходимо проведение повторного тестирования его доступных видов. Дополнительно также может быть исследована плазма крови.

Необходимо учитывать, что частота обнаружения РНК вируса ТОРС в фекалиях выше, чем в материале из дыхательных путей в 1,5 – 2 раза. Однако у некоторых пациентов, особенно на ранних сроках болезни, РНК может выявляться только в материале из верхних дыхательных путей (аспират или мазок из носоглотки).

Каждую пробу клинического материала рекомендуется тестировать троекратно. В случае получения хотя бы одного положительного результата, проба считается первично положительной и в кратчайшие сроки направляется для верификации (приложение №3).

С целью верификации первично-положительная проба клинического материала, (т.е. давшая хотя бы один положительный результат) трехкратно тестируется методом ПЦР с тест-системой, рекомендованной для подтверждения. Необходимо учитывать, что в настоящее время первичный анализ и верификация должны проводиться с одной и той же тест-системой. При условии наличия нескольких зарегистрированных ПЦР тест-систем, наиболее эффективно для верификации дополнительно использовать тест-систему, выявляющую фрагмент РНК коронавируса SARS CoV , отличного от фрагмента РНК, выявляемого в первичном анализе. При этом аналитическая чувствительность референсной тест-системы должна быть не ниже чувствительности тест-системы, используемой для первичного скрининга.

При получении хотя бы одного положительного результата анализа на этапе верификации проба клинического материала депонируется.

Полученные материалы отправляют в Центр специальной лабораторной диагностикии лечения особо опасных и экзотических инфекционных заболеваний (г. Сергиев Посад-6, Московская область) по лабораторной диагностике ТОРС для подтверждения результатов анализа методом секвенирования ДНК.

При получении отрицательных результатов исследования методом ПЦР и при сохранении показаний к обследованию на ТОРС необходимо проведение диагностики методом ИФА с тестированием парных сывороток, взятых с интервалом 2 недели, начиная с 10 дня заболевания. Анализ считать положительным при выявлении сероконверсии или увеличении титра антител в фазе реконвалесценции не менее, чем в 4 раза по сравнению с острой фазой. При получении положительного результата ИФА образцы сыворотки отправляются для подтверждения результата исследования (приложение № 2).

Окончательное лабораторное подтверждение диагноза ТОРС осуществляется лабораториями на основании результатов ИФА исследования и референс центром на основании результатов ПЦР исследования.

При невозможности прижизненного обследования пациента необходимо проведение исследования секционного материала: тканей легкого, сегментарных бронхов, крови, образцов фекалий. Плазма крови и образцы фекалий при этом исследуются по алгоритму аналогичному исследованию клинических проб.

Правила забора, режимы хранения и транспортировки материала для проведения лабораторной диагностики ТОРС представлены в приложении № 2.

При необходимости дополнительного обучения ПЦР-диагностике ТОРС и других инфекционных заболеваний на базе Центрального НИИ Эпидемиологии Минздрава России проводятся круглогодичные 2-х недельные курсы.

Приобретение тест-систем для ПЦР-диагностики и ИФА ТОРС и других инфекционных заболеваний в дальнейшем будет осуществляться за счет средств центров госсанэпиднадзора.

| Первый заместитель Министра | Г. Г. Онищенко

Приложение №1

Информация по комплектации и технологии использования тест-системы
«АмплиСенс Ò SARS » для выявления PНК коронавируса, вызывающего тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС), методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции производства ЦНИИ эпидемиологии Минздрава России

Тест-система рассчитана на 100 постановок, включая контрольные образцы.

Тест-система состоит из четырёх комплектов реагентов:

1. комплект № 1 – «РИБО-сорб» для выделения РНК коронавируса SARS ;

2. комплект № 2 – «РЕВЕРТА- L -100» для получения кДНК на матрице РНК коронавируса SARS ;

3. комплект № 3 – «АмплиСенс-100- R » для амплификации участка кДНК (проведения ПЦР);

4. комплект № 4 – «ЭФ-200» для электрофоретического анализа амплифицированной кДНК.

Комплект №1 рассчитан на выделение РНК из 100 проб, включая контрольные: при тестировании каждых 10 клинических проб ставится по 1 положительному и 1 отрицательному контролю выделения. Если одновременно тестируется менее 10 клинических проб, постановка 1 положительного и 1 отрицательного контроля выделения также является обязательной. В этом случае такие реактивы комплекта №1, как ОКО (отрицательный контрольный образец) и ПКО SARS - rec (положительный контрольный образец), закончатся раньше, чем будут протестированы 100 образцов. Для проведения дальнейших исследований ОКО и ПКО SARS - rec могут быть приобретены дополнительно.

Комплект №2 рассчитан на 120 реакций обратной транскрипции, включая контрольные. Реактивы, используемые для проведения реакции обратной транскрипции ( RT - mix лиофилизированная и РНК-элюент), расфасованы по пробиркам из расчета использования 1 пробирки для тестирования 12 проб (например, после выделения РНК из 10 клинических и 2 контрольных (отрицательный и положительный контроль выделения) образцов).

Комплект №3 рассчитан на 110 реакций амплификации кДНК, включая контрольные. ПЦР-смесь-1 разлита по индивидуальным пробиркам на одну реакцию, в которых затем и проводится реакция амплификации. Остальные реактивы необходимые для постановки (ПЦР-смесь-2, минеральное масло, контрольные образцы амплификации) расходуются по мере необходимости в течение всего срока годности тест-системы.

Комплект №4 рассчитан на 240 электрофоретических анализов. При этом одновременно может быть протестировано не менее 18 проб, неиспользованные реактивы утилизируются. В случае если одновременно тестируется меньшее количество проб, то реактивы данного комплекта закончатся раньше, чем будут протестированы 100 проб. Для проведения дальнейших исследований данный комплект может быть приобретен дополнительно.

По истечении срока годности тест-системы для решения вопроса о возможности продления ее срока годности с разрешения Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича на предприятии-производителе могут быть протестированы архивные образцы, входящие в состав комплектации тест-системы.

Для определения аналитической чувствительности используемой ПЦР-тест-системы; проведения внутреннего контроля качества выполнения ПЦР-анализов; проведения внешнего контроля качества выполнения ПЦР-анализов ЦНИИ Эпидемиологии Минздрава России разработана панель контрольных образцов « Coronavirus -ТОРС». Панель состоит из 3 положительных контрольных образцов (ПКО) рекомбинантной РНК коронавируса ( CoV ), вызывающего тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС, SARS), и один образец негативной плазмы человека. Образец ПКО РНК SARS - rec представляет собой клонированный в ms2 бактериофаге участок генома коронавируса, вызывающего ТОРС. Панель может быть приобретена дополнительно.

Для улучшения качества получаемых результатов применяется транспортная среда. «Транспортная среда для мазков», которая представляет собой раствор сыворотки крови крупного рогатого скота в физиологическом растворе с добавлением консерванта. Наличие консерванта препятствует росту посторонней микрофлоры, сыворотка крови крупного рогатого скота улучшает сорбцию ДНК на сорбенте, а солевой состав и РН физиологического раствора препятствует преждевременному лизису клеток в мазке.

Приложение № 2

Правила забора, транспортировки и хранения клинического материала для лабораторной диагностики ТОРС

Правила забора и подготовки клинического материала для ПЦР-диагностики

Все работы по забору, транспортировке и пробоподготовке клинического материала должны осуществляться с соблюдением Санитарных Правил по безопасности работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности СП 1.3.1285-03, Санитарных Правил о порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1-4 групп патогенности СП 1.2.036-95 и Методических указаний по организации работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-2 групп патогенности МУ 4.2.-0.3.

1. Осуществлять забор клинического материала, строго следуя инструкции, только стерильными одноразовыми инструментами в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры. Работать в одноразовых перчатках.

2. Забор клинического материала должен производиться в пробирки с транспортной средой, предоставляемой фирмой-производителем тест-систем (в случаях, где использование транспортной среды является необходимым). Недопустимо использование транспортной среды других фирм-производителей.

3. Сразу после забора плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек.

4. При переносе клинического материала из пробирок, флаконов в новые использовать только отдельные одноразовые стерильные наконечники с аэрозольными барьерами.

5. При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгиваний и расплескиваний, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей.

6. Строго соблюдать правила хранения и транспортирования клинических проб. Охлаждающие элементы перед транспортированием клинического материала желательно замораживать при температуре минус 70° С.

7. При работах по выделению и очистке РНК из клинического материала использовать расходные материалы (пластиковые пробирки и наконечники) только с маркировкой «DNase, RNase- free» .

Материалы и оборудование, необходимые для забора и предобработки клинического материала для ПЦР-исследования

Материалы:

1. Одноразовые полипропиленовые микроцентрифужные пробирки с завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками объемом 1,5 мл («Axygen», «ИнтерЛабСервис», кат. №№ МСТ-150-С, SТ-150, «QSP», «ИнтерЛабСервис», кат. №№528, 514)

2. Зонды с ватными тампонами («Eurotubo» кат. №300234)

3. Транспортная среда для мазков («ИнтерЛабСервис» кат. № К 1-6-20);

4. Пластиковый контейнер на 60 мл, 30 мл с ложкой («Eurotubo», «ИнтерЛабСервис»);

5. Пробирки Vacuette с ЭДТА-К3, 6,0 мл 13х100 мм («Greiner», Австрия, «ИнтерЛабСервис», кат. №456036);

6. Одноразовые полипропиленовые пробирки с завинчивающимися крышками объемом 50 мл («ELKAY», Германия, кат. №№000-2093, 000-2092/82);

7. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 200 и до 1000 мкл («Axygen», «ИнтерЛабСервис», кат. №№TF-200, TF-200-RS, TF-1000, TF-1000-RS, «QSP»);

8. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 мкл («Axygen», «ИнтерЛабСервис», кат. №T-200-Y, T-200-Y-R, «QSP»);

9. Штативы для микропробирок объемом 1,5 мл («ИнтерЛабСервис», кат. №RA-7215), штативы для наконечников;

10. Емкость с дезинфицирующим раствором (ДП-2Т, «Алтайхимпром», Россия);

11. Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.

Оборудование:

1. Центрифуга «Элекон» (Россия, «ИнтерЛабСервис», кат. №ЦЛММН-Р10-01);

2. Центрифуга/вортекс «Micro-Spin» («BioSan», Латвия, «ИнтерЛабСервис», кат. №FV-2400), «Тэта-2» («Биоком», Россия, «ИнтерЛабСервис», кат. №ВТ-2), «КомбиСпин» («BioSan», Латвия, «ИнтерЛабСервис», кат. №FVL-2400);

3. Микроцентрифуга от 12 до 16 тыс. g для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл – «Hettish» («ИнтерЛабСервис», кат. №Micro-20, Micro-22R), «MiniSpin» («Eppendorf», Германия, «ИнтерЛабСервис», кат. № MS-Ep), «Elmi»;

4. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой («ОМ-1», г. Ульяновск, «ИнтерЛабСервис», кат. №ОМ-1);

5. Холодильник на 2-8° С, на минус 20° С и минус 70° С.

Кровь

Забор материала

Для исследования методом ПЦР необходимо использовать плазму крови. Для проведения ИФА с тест системой «ИФА-АНТИ- SARS - CoV » возможно использование сыворотки или плазмы крови.

Для получения плазмы забор крови производят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или специальную вакуумную систему типа «Venoject» (с ЭДТА), «Vacuett» (сиреневые крышки – 6% ЭДТА). При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую пластиковую пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:20 или 3,8% раствор цитрата Na в соотношении 1:9). Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом).

Для получения сыворотки забор крови проводят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или в стеклянную пробирку типа Vacuette â без антикоагулянта. При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку.

Предобработка проб | Проводится в лабораториях центров Госсанэпиднадзора
Условия хранения материала и предварительно обработанных проб | Образцы цельной крови : - при температуре 2-25° С – в течение 12 часов – для качественного определения нуклеиновых кислот; Недопустимо замораживание образцов цельной крови!

Условия транспортирования материала и предварительно обработанных проб

Транспортирование клинического материала и предобработанных проб осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом.

Образцы крови :

- при температуре 2-8° С – в течение 12 часов – для качественного определения нуклеиновых кислот.

Образцы плазмы и сыворотки :

- при температуре 2-8 ° С – в течение 3 суток;

- в замороженном виде – в течение 1 суток.

Фекалии

Забор материала | Используют пробы фекалий массой (объемом) 1-3 г (1-3 мл). Исследование мазков неинформативно из-за низкого содержания в них возбудителей. Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 1 грамма (примерно) отдельным наконечником с аэрозольным барьером или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон.
Предобработка проб | Проводится в лабораториях центров Госсанэпиднадзора

Условия хранения материала и предварительно обработанных проб

Образцы нативных фекалий:

- при температуре 2-8 ° С – в течение 1 суток.

Фекальная суспензия с глицерином:

- при температуре минус 20 ° С – в течение 1 недели;

- при температуре минус 70 ° С – длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала и предварительно обработанных проб

Транспортирование клинического материала и предобработанных проб осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

Образцы нативных фекалий :

- при температуре 2-8 ° С – в течение 6 часов.

Предобработанные пробы:

- в замороженном виде – в течение 1 суток.

Мазки из полости носа

Забор материала

Мазки (слизь) берут сухими стерильными ватными тампонами. Тампон вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа.

После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой. Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10-15 секунд, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

Предобработка проб | Не требуется
Условия хранения материала | - при комнатной температуре – в течение 6 часов; - при температуре 2-8 ° С – в течение 1 недели; - при температуре минус 20 ° С – в течение 1 месяца; - при температуре минус 70 ° С – длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Условия транспортирования материала | Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: - при температуре 2-8 ° С – в течение 1 суток; - в замороженном виде – в течение 1 суток.

Мазки из ротоглотки

Забор материала | Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой. Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10-15 секунд, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.
Предобработка проб | Не требуется
Условия хранения материала | - при комнатной температуре – в течение 6 часов; - при температуре 2-8 ° С – в течение 1 недели; - при температуре минус 20 ° С – в течение 1 месяца; - при температуре минус 70 ° С – длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Условия транспортирования материала | Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: - при температуре 2-8 ° С – в течение 1 суток; - в замороженном виде – в течение 1 суток.

Смывы из полости носа

Забор материала | Забор материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью зонда или одноразового шприца вводят по 3-5 мл теплого стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного автоклавирования.
Предобработка проб | Не требуется
Условия хранения материала | - при температуре 2-8 ° С – в течение 6 часов; - при температуре минус 20 ° С – в течение 1 недели; - при температуре минус 70 ° С – длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Условия транспортирования материала | Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: - при температуре 2-8 ° С – в течение 6 часов; - в замороженном виде – в течение 1 суток.

Смывы из ротоглотки

Забор материала | Перед забором смывов из ротоглотки проводят предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-15 сек) 8-10 мл изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного автоклавирования.
Предобработка проб | Не требуется
Условия хранения материала | - при температуре 2-8 ° С – в течение 6 часов; - при температуре минус 20 ° С – в течение 1 недели; - при температуре минус 70 ° С – длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Условия транспортирования материала | Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: - при температуре 2-8 ° С – в течение 6 часов; - в замороженном виде – в течение 1 суток.

Мокрота

Забор материала | Забор материала осуществляют в количестве не менее 0,5 мл в одноразовые градуированные стерильные флаконы (пробирки) с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не менее 50 мл.
Предобработка проб | Проводится в лабораториях центров Госсанэпиднадзора
Условия хранения материала и предварительно обработанных проб | - при температуре 2-8 ° С – в течение 1 суток; - при температуре минус 20 ° С – в течение 1 недели; - при температуре минус 70 ° С – длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Условия транспортирования материала | Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: - при температуре 2-8 ° С – в течение 6 часов; - в замороженном виде – в течение 1 суток.

Cекционный материал

Забор материала | В качестве секционного материала используются ткани легких, сегментарные бронхи, кровь, образцы фекалий. Секционный материал тканей легких и бронхов собирают в одноразовые полипропиленовые пробирки с завинчивающимися крышками объемом 50 мл. Манипуляции с образцами крови и фекалий указаны в соответсвующих пунктах данного документа.
Предобработка проб | Проводится в лабораториях центров Госсанэпиднадзора
Условия хранения материала и предварительно обработанных проб | - при температуре 2-8 ° С – в течение 1 суток; - при температуре минус 20 ° С – в течение 1 недели; - при температуре минус 70 ° С – длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Условия транспортирования материала | Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: - при температуре 2-8 ° С – в течение 6 часов; - в замороженном виде – в течение 1 суток.

Приложение № 3

Список учреждений для верификации ТОРС

1. Центральный НИИ эпидемиологии Минздрава России (Москва) - материалы направляются из центров госсанэпиднадзора Центрального федерального округа, Северо-Западного федерального округа, Дальневосточного федерального округа.

2. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово Новосибирской области) - центры госсанэпиднадзора Сибирского федерального округа и Уральского федерального округа.

3. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (Саратов) - центры госсанэпиднадзора Южного и Приволжского федерального округа.